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基于数字微流控的5分钟超快PCR核酸扩增平台

发布日期：2024-01-18点击量：923次编辑：szbyjy_admin

来源：MEMS

聚合酶链反应方法（PCR）在检测时间和灵敏度方面优于传统的微生物诊断，被广泛认为是核酸扩增检测的金标准，通过减小反应体积、缩短反应时间，能够实现超快速PCR。微流控技术因具有减少反应体积和自动化操作的优势被证实为POC分析的理想选择。POCT（即时检测），指在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。基于介电润湿（EWOD）的数字微流控（DMF）平台可以在μL/nL尺度上对单个液滴进行自动化处理，消除对外部支撑元件（如管道、阀门和泵）的需求，同时使用油作为分离单个反应滴的介质，显示出最小的反应抑制和交叉污染。然而，该微流控系统在PCR热循环的高温下容易形成气泡、液滴在热区之间的快速和频繁移动会导致介电击穿、温度传感器对移动液滴温度检测的不准确性等都会影响PCR的耐久性，阻碍了数字微流控平台上超快PCR的发展。

近日，澳门大学贾艳伟教授课题组在顶级期刊Biosensors & Bioelectronics上，以“Sub-5-Minute Ultrafast PCR using Digital Microfluidics”为题发表报道了一种基于介电润湿数字微流控平台的超快速PCR。该研究采用双层加热、多孔超疏水膜、隔温槽、可溶性化学温度传感器等策略，实现准确的液滴内热调节，确保了介电润湿数字微流控平台上PCR的效率和稳定性，检测灵敏度与传统PCR相当，仅需3.7-5分钟。

图1：超快速EWOD PCR系统原理图

为了检测移动液滴的温度，减少传感器与液滴实际温度之间的偏差，研究团队采用一种温度敏感化学染料（磺酰罗丹明B，Sulforhodamine B，SRB）的水性温度传感器对液滴内温度进行准确的校准和调控，以实现高效的芯片上EWOD PCR。由于传统的单面加热器加热方案(MHS)产生的液滴内垂直温度差会影响PCR的效率，研究团队采用顶部和底部双层加热方案（PHS）以减少热损失、提高温度均匀性。

图2：左）SRB温度计校准和液滴温度传感。右）MHS与PHS热传播示意图及比较。

介电击穿是影响EWOD PCR稳定性的主要因素之一。研究团队采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为介电层，PDMS具有对不均匀热应力分布的高耐受性，能够保护电极在高温条件下不被击穿。气泡的产生会导致液滴温度不均匀，并可能中断PCR的热循环，是微流控PCR中常见的问题。该研究采用多孔膨体PTFE（ePTFE）覆盖在半固化的PDMS上作为疏水层，微米级孔隙的ePTFE具有可膨化特性，在热膨胀时不易发生表面破裂，从而抑制了因表面疏水层损伤而产生的气泡。

该研究采用的移动电极联锁排列能够降低移动电极对液滴大小的限制，使得体积大于0.2 µL的液滴可以在30℃以上的温度差下连续移动，不受热毛细管效应的影响。为了实现EWOD PCR的快速热循环，在顶部加热器周围设置了隔热槽，以扩大变性和退火/延伸两个区域之间的温度差。

基于以上技术，液滴在新开发的集成EWOD数字微流控系统上冷热温度区之间稳定移动，在3.7 min内实现了40个循环的超快PCR，比传统的PCR方法加速10-17倍。

图3：上）电极配置方案的演变。其中(iii)为本研究提出的联锁电极结构。下）顶部加热器周围设置的不同深度、宽度和边缘距离的温度隔离槽。

为了消除芯片上PCR的非特异扩增，在PCR配方中加入了可逆热启动试剂（ThermaStop, TS），以防止在低温下产生非特异性产物，并允许在一定温度以上的聚合酶活性完全恢复。同时，考虑到芯片上PCR反应体积缩小，研究团队优化了聚合酶的浓度、芯片上的基础温度、液滴在变性区和退火/延伸区停留的时间，从而实现更高的效率。连续梯度稀释实验证实了超快速PCR数字微流控芯片的灵敏度与传统PCR一致，其扩增效率达到95.31%。

图4：EWOD PCR每5个循环获得的时间过程荧光图像

该数字微流控平台采用微米级多孔ePTFE膜作为疏水层，PDMS作为介电层来抑制气泡的形成和介电击穿，这些材料的结合使用有效地增强了EWOD芯片的耐用性。体积为0.6μL的超快EWOD PCR在3.7至5.0分钟的时间内成功完成40个热循环。这为NAAT在感染性病原体检测、耐药性分子筛选、法医学和其它基于PCR的实际应用提供了可能性。

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