血液中存在一些丰度极低的细胞，如循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、母体外周血胎儿有核红细胞（nucleated red blood cells，NRBCs）、循环内皮细胞、免疫细胞亚群、干细胞等，其中的CTCs和NRBCs因明确的临床价值而备受关注。

CTCs是由实体瘤原发灶或转移灶脱落扩散到外周血液中并随血液循环的肿瘤细胞，有研究表明CTCs可导致肿瘤转移的发生。而且CTCs在肿瘤原发灶和转移灶之间参与信息的传递，并可调控肿瘤行为。有效捕获CTCs并对其进行基因及分泌物检测，对恶性肿瘤的早期诊断、术后评估、个性化治疗以及肿瘤耐药性评估等具有重要的指导意义。NRBCs则在胎儿产前诊断中具有重要意义，产前诊断是指胎儿出生前的系列检测，以判断胎儿是否患有遗传疾病或先天畸形，如基因拷贝数变异、唐氏综合征等。临床在用的产前诊断手段包括羊膜腔穿刺、脐带取血等有创诊疗手段，以及血清筛查、超声检测等无创诊断技术。有创产前诊断属于侵入性手段，对胎儿和母体风险大，接受度低；而血清筛查、超声检测等方法的假阳性几率大，特异性低。因此，临床上迫切需要易接受、精确度高的产前诊断技术。NRBCs包含胎儿的完整遗传信息，在孕早期的母体外周血中含量较其他胎儿细胞多，分娩几天后从母体中消失，不会与母体细胞混淆，是目前开展微创产前诊断的首选靶细胞。

CTCs和NRBCs在血液中的含量极低，每毫升血液中正常血细胞数量超过10^9个。其中CTCs和NRBCs只有几个到几百个，而且CTCs的表面抗原表达呈明显的异质性，同一类肿瘤细胞甚至同一患者的同一类肿瘤细胞的表面抗原表达也不尽相同，从而使分离和富集非常困难。探索开发高效率、高纯度、高特异性的分离和富集方法，并将富集到的细胞无损释放然后进行培养，用于下游基因检测及分析，已经成为目前基础和临床医学研究的又一热点。

从血液中分离和富集稀有细胞的方法主要包括物理方法和免疫亲和法两类。 物理方法是基于CTCs和NRBCs在大小、密度、流动惯性、变形性以及电学性质等方面与其他血液细胞的不同来进行分离；免疫亲和法则是依据细胞膜表面表达出的特异性抗原差别，利用抗原-抗体的特异性结合来识别目的细胞，实现稀有细胞分离和富集。

研究表明，单一方法分离和富集稀有细胞的效率较低，难以满足临床需求，利用综合手段满足高效率、高纯度以及高特异性的要求，是目前的主要努力方向。CellSearch系统是目前唯一通过美国食品与药品监督局认可、用于临床的CTCs分离和富集系统，效率可达80%，但假阳性比率偏高，富集到的细胞往往无生物活性，而且该系统仅能捕获表面表达EpCAM的CTC细胞，对于其他CTCs则很难被检出。2016年，Cytoplo Rare叶酸受体阳性CTCs检测试剂盒获得中国国家药监局批准，工作原理与CellSearch类似。

近年来，在传统分离技术(密度梯度离心、流式细胞术、单细胞显微操作等)上结合纳米技术、微流控技术的稀有细胞分离研究增多，在一定程度上满足了在小样本上实现高效率捕获的要求。下面在物理分选法和免疫亲和法的基础上，讨论近年来稀有细胞分选的研究状况和进展。

稀有细胞的物理分选仅依赖细胞本身的物理特性，不依赖细胞表面特异性受体的表达，不会因为细胞表面标志物的识别过程而影响稀有细胞本身的生物学特性，有利于下游检测和分析。

1、利用细胞大小差异进行分离

CTCs和NRBCs等稀有细胞通常大于普通血细胞，而且CTCs更容易团聚成团簇的状态。利用这种细胞尺寸的差异，可以在微流道或者过滤膜上，制备出只允许较小的血细胞通过而较大的稀有细胞被滞留的微结构，从而实现细胞分选。

Hosokawa等在聚二甲基硅氧烷(PDMS) 上制备了微孔直径8~11μm的过滤膜(见图1(a))，小直径的正常血细胞可以透过微孔进入到过滤膜下层，而尺寸较大的稀有细胞被滞留在上层通道。这种分离过程简单直接，但微滤孔易堵塞，且样品流通量小、速度慢，效率较低。Wu等利用如图1(b)所示的装置解决了上述问题：在PDMS芯片构建7条平行通道，并等间距设置微室，这不仅增加了样本流通量，而且靶细胞被富集到微室中，可以防止微孔堵塞。Li等进一步在微流控芯片流道上制备了约2μm长度的氧化锌纳米柱列结构(见图1(c))，将CTCs滞留富集在芯片内部，而不仅仅是在出口处，有效避免了堵塞，由于CTCs体积和核质比较大，且表面具有丝状伪足等微纳米结构，纳米柱列结构的存在大大提高了捕获效率。用稀磷酸腐蚀氧化锌纳米基底可以轻易释放靶细胞，以便进行下游检测分析。结果显示，这种楔形结构捕获效率可达87.5%，释放效率为85.6%，反向收集培养1h后细胞活性为73.6%，3d后活性为93.9%。

利用细胞尺寸大小进行分离不需要标记细胞，保持了细胞的原始状态，但由于稀有细胞和血细胞尺寸存在重叠交叉，因而分选纯度较低。所以，很多研究者利用流体力学性质，将细胞间微小的物理差异进行放大来提高分选纯度。

2、利用流体力学性质进行分离

细胞随着流体在流道中运动时，由于尺寸和密度不同会产生不同的运动轨迹，再进一步结合不同的流道结构，可以使运动轨迹的差异进一步放大，从而实现稀有细胞的分离和富集。

Yamada等首先提出夹流分选方法（flow fractionation），Lee等将夹流分选的原理运用到稀有细胞分离领域，并结合十字交叉流实现动态分离，有效避免了微流道堵塞的问题(见图1(d))。他们在芯片内部设置一组和流动方向呈一定角度的微柱阵列结构，柱列间距大于正常血细胞而小于胎儿有核红细胞。Port2处混合细胞在Port1处的PBS推动下充分混合前进，尺寸较小的正常血细胞沿着原轨迹运动，尺寸较大的细胞则在PBS带动下向一侧偏移,结果显示有74%的NRBCs在Port3处被富集，无损收集到的NRBCs可以满足胎儿产前诊断分析的要求。但是，这种方法样品通量仍然偏小，难以快速分离出靶细胞，无法满足临床快速检测的需求。Sollier等利用惯性聚焦原理，设计出高通量的稀有细胞分离芯片(见图1(e))，该芯片具有8个并排的微通道，每个微通道有8个微室，当细胞从微通道进入微室时，管壁效应升力突然消失，细胞受到的力失去平衡，正常血细胞的受力较小，单独的梯度剪切升力不足以使其偏离轨道，所以正常血细胞沿着原有的轨道继续前进，稀有细胞会偏离中心轨道进入微室而被收集，成功地从患者外周血中捕获到CTCs，这种并联微通道方法有效解决了样品通量小、分离效率低的问题，同时微室可以有效解决传统方法容易堵塞的问题。Warkiani等设计出一种新型螺旋式微流控芯片，将传统的矩形截面转换成梯形截面，从而实现细胞的无标记连续分离。在这些芯片一次仅能分选出一种尺寸的稀有细胞基础上，Mehendale等将纳米柱列结构依据不同原理组合在同一微流控芯片内，可以同时分离多种尺寸的细胞。

在利用流体力学性质进行稀有细胞的分离分选时，可以将尺寸、密度等微小差异放大，以提高分选的纯度。分离时不需要对细胞进行特殊处理，只需要改变微通道的结构，就可以实现细胞的分离，但基于血液成分的复杂性，如何设计出更高效率、更高通量的分离结构，仍是该方法的研究重点。

3、利用介电性质差异进行分离

不同细胞具有不同的介电性质，因而在电场中所受到的电场力的大小和方向会有所差异。在外加电场的作用下，不同种类细胞的运动轨迹会有所差别，利用这种性质也可以实现细胞的分离和富集。

Braschler采用双向电泳（two-dimensional electrophoresis, DEP），实现了对失活和未失活酵母细胞的分离，分离效率达到100%。Moon等在PDMS基底上制备了由金导线提供电场的芯片(见图1(h))。细胞混合液在第一分离区实现初步富集，尺寸较大的细胞进入第二部分的电泳分离通道内部，利用DEP效应可以在通道内实现对细胞的电泳分离。实验证实，对CTCs的分离效率达到75.18%。

基于物理性质分选的优势在于不需要对细胞进行特殊处理，富集后的细胞可继续培养来用于临床分析检测。但是，过滤等方法易堵塞，并可能对细胞本身造成机械损伤。由于血液成分复杂，黏度较高，所以利用流体力学性质进行分离也容易出现假阳性的现象ꎮ。双向电泳对细胞的分选纯度高，但微弱的电泳力很难快速感应到CTCs，难以实现快速分选，富集效率偏低。此外，物理方法仅依据细胞大小、介电常数等微弱差异进行分离，特异性相对较差，分选纯度有待提高。因此，单独的物理分选方法很难有效实现稀有细胞的分离和富集，需要寻找更高效的分离方法，从细胞生物学角度看，稀有细胞表面往往表达特异性受体，可以和特定的免疫亲和分子(抗体、适配体、亲和素)相结合，因此利用免疫亲和法进行分选可以在一定程度上弥补了物理分选法的缺陷。

图1、典型的稀有细胞分选方法。(a)~(c)基于细胞大小进行分离；(d)~(e)利用流体力学性质差异进行分离；(f)利用介电常数差异的分选方法；(g)介入导管表面固定化抗体分选；(h)双向电泳分选。

免疫亲和法，是利用细胞表面的特异性受体与抗体、核酸适配体进行的免疫亲和反应所产生的差异来分离和富集稀有细胞。一般是把免疫亲和分子修饰在材料表面，当表达相应受体的细胞与材料表面接触时，会和表面的免疫亲和分子特异性结合，从而滞留在材料表面，再结合适当的释放方法，如酶解释放、温控释放、化学竞争释放、光解断键等，使稀有细胞从材料表面脱落，以用于进一步的检测分析。免疫亲和方法分离和富集的纯度高、特异性强，特别是随着纳米技术和微流控芯片制备技术的完善，免疫亲和方法成为分离富集稀有细胞的主要方向。

1、基于化学修饰的材料表面分选

在材料表面简单直接修饰抗体、适配体，可以获得稀有细胞结合位点，可以满足稀有细胞分离富集的高通量要求，有利于下游基因检测和分析。Liu等在毛细管壁上修饰生物素化的适配体，当靶细胞流经毛细管时与适配体特异性结合，再通过生物素竞争反应，可以将捕获到的细胞无损释放，对CTC的捕获率达85%。Wang等对尼龙导丝进行简单化学修饰(见图1(g))，并连接抗体植入小鼠体内，成功捕获到CTCs。Cao等将电解池中的多孔氧化铝薄片的一侧修饰了特异性适配体，当靶细胞与适配体结合时，多孔氧化铝表面的离子转移通道受阻，而酶解释放细胞时离子转移通道可以恢复，利用电化学线性扫描伏安法，实时检测电解池中电流的变化，可以监测靶细胞捕获和释放的过程，细胞捕获效率为70%，细胞释放率为98%，释放后细胞存活率为94%。

但是，宏量修饰得到的具有免疫亲和分子的有效面积都比较小，低丰度的靶向细胞和材料表面接触机会少，而且全血成分复杂，很可能掩盖有限的捕获位点，所以要满足临床需求仍需进一步改进。

2、免疫亲和分子修饰的磁性材料

磁性纳米粒子可以和多种免疫亲和分子耦合，形成所谓的“免疫磁珠”，当细胞接触免疫磁珠时，会被特异性捕获，进而在外界磁场作用下被分离和富集。

Nagy等首先利用双密度梯度离心的方法，去除大部分普通血细胞，初步富集NRBCs；然后再和连接有anti-CD71的免疫磁珠混合，通过磁场进一步富集NRBCs，经PCR扩增后，在14个样本中准确诊断出11例胎儿的性别以及2例克兰费尔特综合征。Earhart等制备了磁性软坡莫合金微孔滤网，细胞和免疫磁珠共同孵育一段时间后，在流经滤网时被滞留在微孔上，从而实现靶细胞的分离。Byeon等将流体力学、阴性选择和免疫磁珠方法结合，设计了动态分离装置：首先去除母体外周血中的红细胞，得到初步富集的单核细胞富集液，然后通过磁性微分离器进行阴性选择，结果显示第一部分红细胞去除率达93.98%，胎儿有核红细胞损失率仅为6.02%；同时对捕获的细胞进行SPY染色体检验，证明富集到的靶细胞包含胎儿遗传信息。

类似地，Toner等设计了集流体力学特征和免疫磁珠于一体的CTC-iChip。首先利用流体力学的确定性侧向位移特征去除全血中尺寸较小的红细胞、血小板等ꎬ然后尺寸较大的白细胞和CTCs流经微通道并与免疫磁珠结合，再利用连续弯道聚焦和外界磁场分离富集免疫磁珠标记的CTCs。研究对比了阳性和阴性选择，发现：阳性选择的分选纯度高，但很难富集EpCAM低表达的CTCs，而阴性选择保持了CTCs表面分子性状，但分离和富集纯度较低。

整体上看，磁性纳米粒子比表面积大，可按需耦合多种免疫亲和分子，可设计性强。同时磁性纳米粒子可操纵性好，分离和富集效率高，细胞被富集后活性保持较好。

3、基于材料表面微细结构的分选

材料表面的纳米结构可以模拟人体细胞外基质和基底膜的纳米拓扑结构，使细胞更容易附着和生长，因此基于材料表面微细结构进行稀有细胞分选常常会采用纳米结构作为分离装置的基底，而且纳米结构具有的高比表面积特征，可以修饰更多的免疫亲和分子，从而提高捕获效率。有研究报道，具有纳米结构的材料表面即使没有连接免疫亲和分子，也可以稳定附着、捕获CTCs。

Wang等在硅片上制备了硅纳米柱阵列结构并固定anti-EpCAM抗体，发现CTCs捕获效率(45%~65%)是平面硅基材的10倍；进一步将硅材料改为温敏性材料，在同样的纳米柱阵列结构上实现了靶细胞的无损快速释放。但是，在玻璃基底上制备类似的纳米柱阵列结构并修饰两种适配体时，因为两种适配体之间形成杂二聚体的位阻效应，其捕获效率低于单适配体修饰时的效率，这说明免疫亲和分子修饰并不是越多越好，需要注意免疫分子之间以及免疫分子和靶细胞之间的空间位阻障碍。Hou等在聚乳酸纳米柱阵列结构表面首先修饰链酶亲和素，然后再修饰生物素化的抗体，这样抗体和基底之间有链酶亲和素-生物素柔性链的缓冲，靶细胞更容易与抗体结合，可以有效获得足够数量的目标细胞，为产前诊断提供有效信息。

纳米纤维具有高比表面积，还可以在表面修饰多种免疫亲和分子。Xu等利用静电纺丝制备了聚乳酸-聚羟基乙酸纳米纤维，成功修饰叶酸和透明质酸分子，然后将功能化纳米纤维包埋在微流控芯片内部，以叶酸受体高表达的KB、Hela等细胞和低表达的L929细胞为模型，证实功能化的纳米纤维可以实现动态特异性捕获叶酸受体高表达的CTCs（细胞捕获效率达90%以上）。Zhang等同样通过静电纺丝技术制备二氧化钛纳米纤维，并进行化学修饰连接相应抗体，实现了稀有细胞的捕获。

细胞表面具有的纳米拓扑结构是天然的纳米基底。Huang等以胞吞磁性纳米粒子的巨噬细胞为模板，采用高温煅烧等方法，使具有硅纳米颗粒表面的巨噬细胞保持原有的纳米拓扑结构并修饰anti-EpCAM，可以特异性捕获EpCAM高表达的MCF7细胞，再利用二硫苏糖醇破坏二硫键实现了目标细胞的无损释放，结果显示特异性捕获效率为53%，释放效率为89%，释放后细胞存活率为96%。

随着研究的不断深入，对稀有细胞捕获不仅关注数量，而且也希望捕获到活性更高、携带更多信息的稀有细胞，并期望对针对性捕获的稀有细胞进行原位检测分析。3D细胞培养技术、微流体液滴技术以及各种限制场技术的发展，为稀有细胞分离和富集提供了更广阔的应用前景。

Liao等通过阴性选择，去除外周血中98.8%的CD45表达阳性的白细胞，试图富集CTCs，但由于CTCs丰度太低，阴性选择后白细胞依然占很高比例(85.4%~90.7%)。在之后的体外细胞培养中，正常血细胞逐渐凋亡，而CTCs依然保持较高活力，8天后CTCs纯度大大提升。这种方法无需对肿瘤细胞进行标记，纯化过程简单，培养后目标细胞数量有所增长，可以获得足够的样本供下游检测分析。

Linas等利用微流体液滴分装单个细胞，通过调节液滴大小和溶剂模拟体内微环境，并结合单细胞显微操作仪，实现了对细胞分泌物的实时动态监测(见图1(h))。

高度聚焦的激光会产生光辐射压形成三维光阱，产生的力可以将细小的颗粒移动到光阱处，形象被称为“光镊”。目前已经有了传统光镊、全息光镊、等离子体光镊和光纤光镊等多种类型。利用光镊进行细胞操作时，精度或灵活性均较高，而且对稀有细胞无损伤，与微流控芯片结合，可以进行三维旋转操控，实现对单个细胞的捕获和分析，例如，Liberale等通过对光纤断面进行微处理，并结合微流控芯片，就实现了对细胞的捕获。

利用声场也可以实现细胞的分离，Li等在微流控芯片的两侧设置一组和流体呈一定角度的声波传感器，相对的声波相遇时会产生压力节点，当尺寸、压缩性等有所差异的细胞以层流方式流经这些节点时，受到的声波辐射力不同，会产生不同程度的偏移，优化声波与流体运动方向的角度以及微流控芯片的长度，可以得到最佳的分离效率。实验证实，CTCs和白细胞分离的效率可达83%，同时成功地从患者全血样本中捕获到了CTCs。

在用限制场技术进行稀有细胞分离和富集时，无需对样品进行标记，也不需要机械接触细胞，保留了细胞最原始的状态，同时可以对收集到的细胞进行后续培养以及分析检测。但这些方法对设备的精度要求较高，只能对微量样品进行检测，也很难对全血直接进行检测，将全血样品初步分离后再利用限制场技术进行单细胞操作，可能是今后的发展方向。

相对于其他侵入性检测手段，稀有细胞具有标本可重复、可实时检测的特点，目前已成为临床液体活检的重要对象。但血液成分复杂，而稀有细胞含量少、背景干扰多、分离纯度欠佳，给下游检测分析带来了巨大挑战， 目前，已有多种稀有细胞分选设备进入市场，如根据免疫亲和性分离的CellSearch系统、根据细胞大小差异进行分离的ClearCell系统、依据流体力学性质差异进行分离的Apostream系统，以及根据双向电泳原理进行分离的DEPArray系统等，但上述检测设备都还没有达到公认的最优化标准。不同检测设备的检测精度都比较低，实现稀有细胞高纯度、高活性、高特异性捕获依然面临巨大的困难。

在根据物理和免疫亲和性质进行细胞分离富集时，如果仅在宏观尺度利用单一性质进行分离，则纯度和效率很难达到临床需求。将物理和免疫亲和性与纳米材料、微流控技术相互结合，设计多种方法结合的分离和富集方法，是目前稀有细胞捕获的重要研究方向，纳米材料具有特异的拓扑结构和较大的比表面积，可以增大目的细胞和基材接触的几率，微流控芯片取样少，适合流体操控且易集成，适用于稀有细胞分离和富集领域，随着单细胞显微操作等技术的发展，使单细胞水平的检测分析成为可能，单细胞分选技术结合全基因组扩增，可以对分选出来的细胞进行基因组、转录组以及蛋白质水平的研究，为产前诊断和肿瘤的个性化治疗等提供了重要的基因依据，进一步研究稀有细胞的生物学特征，改善纳米材料、微流控芯片的结构，开发具有高度可重复性的检测系统，是这一领域未来的主要方向，意义重大。

宋婉云，王惠宇，王明明，张弢，血液中稀有细胞分离和富集方法研究进展（2019），中国生物医学工程学报，38（4），481-489

来源：IVD分享库

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