多重PCR也是分子检测领域比较热门的一个方向，最近很火的一个原因，将其用在靶向测序tNGS上面，真正的做到了一百多重，虽然多重PCR的理论基础支持做到百重、千重等等，但是实际上做到二三十重已经到了极限，主要的原因是信号标记特异性和检测技术的灵敏度还远远达不到理论值。

为什么实操上就有很大的难度？

这么多的技术路径，为什么现在好像做出来的产品很少，最多做到30多重就没法往上了，这就回到我们今天的第二大板块的内容，理论值可以，但是实操起来就不行。

（1）荧光基团的相互干扰

在多重qPCR中针对不同靶标的检测，需要设计不同的探针、选用不同光谱范围的荧光基团。虽然许多荧光光谱相似的荧光基团的最大发射波长不同，但在附近的波段内，它们仍然会相互重叠，因此荧光基团的发射光谱之间的相互干扰就成了限制多重PCR发展的最大难题。目前普遍水平能够调配到4-6色荧光通道之间的不干扰，再继续增加信号通路干扰越大。

（2）多靶点的扩增效率差异

在PCR扩增的过程中，较高丰度的靶点往往会抑制较低丰度基因的扩增，所以在设计多重分析时，应根据 PCR 反应中各基因和基因产物的 DNA 或 cDNA 绝对丰度，识别多重反应中哪种基因或哪些基因有可能引起饱和，需要在引物设计上做一些预防措施。

需要指出的是多重PCR实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系。多重PCR之所以难，还难在多个靶点之间扩增条件不兼容，每个靶点都需要旁边其他的引物配合。

（3）引物二聚体

传统单管多靶标扩增的方式通过不断优化反应体系中缓冲液、酶、引物、探针等的用量，确保每一重的扩增效率保持一致，然而随着检测重数的增加，形成二聚体甚至多聚体的可能性也大幅上升，轻则导致非特异性扩增的出现，靶标扩增效率下降，检测灵敏度和特异性降低，重则导致非特异性扩增占据主导，靶标扩增失败，造成假阳性和/或假阴性，影响检测准确性。

（4）信号检测精确度不足

不管是多重的探针设计还是微流控的多孔设计，在信号的检测和分析上都是一个不小的挑战，尤其是实现实时检测，众多信号交叉在一起，同时差异又特别小，则对相机精密度要求更高。

综上所述，多重PCR技术虽然目前有很多实现路径，而且其具有多重、快速等特点，在理论层面具有非常大的想象空间，但是其也面临着各种技术实现上的难题，若能有所突破，未来其应用场景会将PCR带入一个全新的时代。

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